分子免疫学在中药质量标准研究中的应用

中药的质量标准研究除少量采用形态法(包括显微)外，一般均用现代理化分析方法。直到1995年版药典，中药质量标准尚未有分子生物学理论和方法的应用，这与当今分子生物学的发展是极不相称的，也不利于中药自身发展及指导临床。我们从1993年起提出应当以中药品种分子遗传特征进行中药质量标准研究的新思路，并陆续在牡蛎、珍珠母、两种爬行动物及人参属的专属性鉴别中取得成功，多次获得各种基金项目资助。本文结合我们的工作，简单介绍分子免疫学在中药质量标准研究中的应用。1　特点大多数植物的初级或次级代谢产物，因其专属性强，又可与化学对照品比较测定，常作为中药质量标准或指标性成分。但是单一化学成分所携信息量有限，不同亲缘种，亚种间常含相同成分，例如黄柏与黄连均含小檗碱。同一品种在环境因素作用下也可能含不同质和量的化学成分。至于动物类中药，由于缺乏特异的次级代谢产物，更难以某种“化学成分”进行专属鉴别。分子生物学研究决定遗传特征的信息大分子，包括DNA、RNA及蛋白质，故可针对中药的物种进行鉴别和质量评价。以分子遗传标记进行中药鉴别，由于可以区别亲缘关系的种、亚种甚至居群，对环境因素有较大保守性，将会对中药的分类学、药剂学及质量标准研究产生极其深刻的影响。我们认为以中药物种遗传特征作质量标准或者作理化分析的补充，有利于保护地道药材，有利于临床根据中医理论用药，也有利于市场防伪。由于国外容易接受药材种属遗传特征的质量观念，反而不理解诸如小檗碱作为天然黄连质量标志的习惯，所以也还有利于出口准入。对于动物类中药，甚至可能成为解决专属鉴定的基本方法。2　现状2.1　传统蛋白质分析　早在20多年前即有人提出以种属蛋白特征进行中药鉴别思路，先后报道氨基酸含量、电泳、同工酶及免疫血清等，至今仍在继续。主要问题是不规范，难以重复。鉴于部分中药材及制剂中蛋白已有不同程度的水解，故近年发展的X衍射、核磁共振、质谱、HP以及毛细管电泳等测定蛋白质的新技术，均难以直接用于质量标准。一般免疫化学法采用全价抗原分析，却不能用于亲缘接近的品种鉴别。2.2　DNA分子标记　DNA作为遗传信息的直接载体，不受环境因素、个体发育阶段及组织部位影响。而且DNA化学稳定性高，在一般贮存条件下不易降解，所以近年DNA分子标记鉴别发展很快。从1994年香港中文大学首次报告随机引物多聚酶反应(AP-PCR或RAPD)鉴别人参和西洋参以来，鉴别的中药已达30～40个品种，有的甚至申请了专利。但是目前DNA鉴别仍限于中药材的分析，对于多种中药组成的复方制剂，随机多态分析技术不适用于混合模板。建议加快建立重要中药材基因库，寻找出品种高度保守的特异DNA序列，合成专属的引物，才能真正应用于中药制剂的质量标准研究。2.3　蛋白质分子免疫标记　我们1993年承担海王“金牡蛎胶囊生化免疫鉴别及含量测定研究”项目中，提出了一个不同于传统蛋白质分析的思路。其核心是确证55KD多肽是牡蛎种属特征蛋白(抗原)，纯化并制定该蛋白质的质控条件，制成免疫学对照品。然后免疫动物制备抗体作为检测药盒。采用不同方法可在10-3g及10-9g范围与其他贝类鉴别。其线性、精密度、重现性和稳定性及回收试验等方法学考察，均接近理化分析要求。实际上已用于企业内部质量标准，其后证明用此方法可检出健民“龙牡壮骨冲剂”中极微量的牡蛎蛋白。1995年我们确定14.6KD及10.2KD多肽分别是两种爬行动物各自特征蛋白后，首次测定了它们的氨基酸序列，人工合成“对照品”。1998年又从马氏珠母贝外套膜中找到一个与珍珠层共有的抗原成分。由于分子免疫标记方法可以确证一个免疫学对照品，用特异抗体进行专属鉴别及药材与制剂含量测定，容易与现行中药新药质量标准研究的要求接轨，技术也比较成熟简便，可望先于DNA标记应用于实际生产中。最近，我们进一步提出了“人工合成种属特征多肽对照品→工程抗体检测”的中药分子免疫学质量标准研究的新模式。3　主要步骤及关键技术3.1免疫学对照品的设立和质控3.1.1中药材种属特征蛋白的确证：能否取得含量丰富、抗原性强，既是药典规定入药的各亚种间共同蛋白，又不与其他类似品种交叉的特征多肽(抗原)，是整个质量研究成败的关键和难点。除经典的电泳分析(SDS-PAGE、Native-PAGE、IEF、2D电泳、糖蛋白电泳)外，推荐“免疫吸收印迹电泳”技术。即先将药材提取蛋白质，免疫动物制备全价抗血清，逐一加入待鉴别品种“吸收”血清中交叉的抗体，然后用吸收后血清作一抗进行免疫印迹(westernblot)，未被吸收的组分极可能具特异性。再结合分子量，等电点及排除糖蛋白、脂蛋白后，可确定为该种属特征蛋白(一个或几个)。3.1.2种属特征蛋白纯化及多克隆抗体制备：目的是对初步确证的蛋白质作进一步考察。如果仅作市场防伪或企业内部质控，提取的蛋白质只要分子量明确，SDS-PAGE基本上一条带，交叉免疫单一峰，再测定蛋白质含量，即可作为粗对照品。以此免疫家兔，测定抗体滴度大于1/64，制备IgG酶结合物，已可满足应用的要求。特征蛋白纯化可从SDS-PAGE直接制备，但多数情况下仍使用盐析(分子筛)或凝胶过滤(离子交换方法)制备。3.1.3种属特征短肽序列分析：天然纯化的蛋白质分子量仍较大，性质不均一，其质量受提取方法影响很大，与化学对照品技术要求距离较大。我们认为，用于中药新药质量标准的免疫学对照品，应当具有氨基酸序列清楚、抗原性专一、稳定性强及便于制取供应等条件，只有简单线性多肽能符合这些条件。所以需对粗纯特征蛋白进行切割，直至获得具有种属抗原决定簇的肽。“有限酶切电泳印迹法”是较好的技术，方法是把纯化或SDS-PAGE上的特征蛋白区带置另一SDS-PAGE加样槽，同时在槽内加蛋白酶，电泳后水平转印至2～3张PVDF膜，一部分作免疫印迹分析，另一张把保留抗原性的最小肽剪下测定氨基酸序列，即可获该品种特征短肽。如1号爬行动物的14.6KD组分，其特征短肽由19个氨基酸组成，N端5个依次为ANVDA，C端为G；而其亲缘关系极近的2号爬行动物，10.2KD组分的特征短肽由12个氨基酸组成，N端5个依次为LSDDE，C端为I。3.1.4种属特征短肽人工合成：由于抗原决定簇表达只须一级结构，可采用固相多肽合成法制备，简单过凝胶柱纯化及验证抗原性存在，即达到免疫学对照品要求。至于采用噬菌体肽库技术确定特征短肽，简并寡核苷酸合成小肽CDNA片段在噬菌体颗粒表面表达这一短肽，可能更快捷有效，但我们尚无这方面的经验。3.2检测试药——特异抗体制备　常规制备多肽抗体，可采用半抗原联接蛋白形成完全抗原，产生多克隆或单克隆抗体。近年来第三代抗体，即工程抗体技术已商品化。为提供标准化的抗体库，厂家备有多个系统试剂盒。只须从免疫小鼠脾淋巴细胞或杂交瘤细胞，提取mRNA与药盒的引物作PT-PCR克隆Vh和Vk基因，经DNA接头连接后与噬菌体PCANTAB5重组，转化大肠杆菌制备抗体进行“吸附—洗脱—扩增”的筛选富集，再经转染即可得到高亲和力的抗该种属特征短肽的单链抗体。随基因工程技术普及，估计工程抗体生产成本还会降低。3.3专属鉴别及含量测定方法3.3.1一般免疫化学法：采用免疫沉淀技术，适用于10-3g～10-5g范围特征多肽的鉴别。例如免疫双扩散用在专属鉴别及火箭电泳用来进行含量测定。该方法假阳性少，质控好。3.3.2　酶标记免疫法：有的中药含特征多肽量极微，如珍珠、牡蛎等，须高达10-9g以上才能检出。通常采用酶标免疫，甚至放大技术。斑点酶联免疫分析(DIBA)可以鉴别，将1～2μl中药提取液点样在NC膜上，用直接或间接酶结合抗体检测，阳性斑点呈红褐色。我们在牡蛎制剂鉴别中可达1ng。含量测定则用酶联免疫吸收分析(ELISA)，用双抗体夹心测定牡蛎特征蛋白，在0.05μg～0.90μg呈线性，RSD为6.6%，平均加样回收率110%，最低检测限5ng。近年来发展的增强化学发光及免疫PCR技术，使检测限提高到10-12g以上，将会使分子免疫学进行中药质量标准研究更灵敏。有关人工合成对照品与天然蛋白质，工程抗体与天然抗体间反应有何差别，孰优孰劣?还有待实践后回答。分子生物学用于中药质量标准研究才刚起步，究竟哪些中药适于理化分析，哪些适于DNA分析或适于分子免疫分析，也要实践后总结。目前，应当集中力量进行中药免疫学对照品研究，争取获得药检部门的认定和通过审批程序进入中药新药质量标准，并且最终收载入药典。最近有学者强调草药质量标准可能形成两个分支：一支是接近化学药品质量标准的对某一化学成分的定性定量分析，另一支是“全成分”的色谱图象或指纹图谱分析。并且明确指出后者可提供对品种辩认的更多信息，更适应中医传统理论的需要。本文介绍从人工合成特征多肽对照品到工程抗体检测的模式，实际上可以归入前者。所以，我们也在考虑中药品种蛋白指纹电泳图谱用于质量标准研究的模式。在建立Panax属西洋参、人参及三七蛋白鉴别电泳指纹图时，注意到中药材蛋白提取标准化，均经脱脂、浸取、盐析及冻干，在5mg/ml左右等蛋白恒定条件电泳。而且采用Native-PAGE.Tricine-PAGE,尤其是免疫印迹及交叉吸收免疫印迹电泳，辅助SDS-PAGE，以确定每一指纹区及重要区带的特征和意义。我们比较不同来源西洋参15种，人参10种，三七4种，表明Panax属三种药材分为三个特征区。由28KD至58KD及其中55KD等2～3条多肽组成共有的蛋白质指纹区，对该属鉴别意义重大。28KD以下指纹区西洋参由4～5条几乎等距区带组成，这是该品种独特的指纹图，58KD以上指纹区对人参鉴别可能具有意义。市售真伪洋参丸可通过蛋白电泳指纹图区别，指纹图的改变还与入药部位、产地及质量有关。下一步研究的关键是在中药制剂(复方)中，如何把该品种的指纹识别出来，需要借助计算机进行信息比较分析。也可以结合上文，将品种特征蛋白的免疫识别与常规电泳相结合。由于中药蛋白指纹电泳谱属“图谱测定”范畴，不涉及免疫学对照品设立及药盒审批程序，可能是分子免疫学应用到中药质量标准研究中的一条捷径；并可与特征蛋白检测互相补充，走出一条新路子。