中药复方消癌根对肿瘤生长的影响

材料与方法（一）实验动物昆明种小鼠60只，4～6周龄，体重18～22g，雄性，购自南方医科大学动物中心。实验前分笼饲养适应环境1周，实验过程中动物自由摄食、饮水，鼠房保持通风，室温保持在25±2℃，光照周期12/12小时。（二）细胞株细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞，皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所，常规复苏传代培养。（三）主要药物、试剂和仪器中药复方消癌根，由董草原医生提供。环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号02071121。（四）消癌根药液的制备消癌根是由纯中药粉碎而得的黑褐色药粉。根据人与小鼠药物剂量换算公式：d小鼠=d人×（k小鼠/k人），（k小鼠、k人分别为小鼠和人的折算系数）算出小鼠每日给药剂量。取体重为50kg正常成人每日口服消癌根剂量为9g，算得小鼠每日给药低剂量，再将其剂量增加一倍设为高剂量；然后算出药液所要浓度。用蒸馏水将消癌根分别配成每毫升含0.10g、0.05g生药的高、低两个剂量组的悬浊液，4℃冰箱保存，用时摇匀。用无菌生理盐水将环磷酰胺稀释成为2mg/ml，4℃冰箱保存。（五）荷瘤小鼠模型的建立体外复苏培养S180细胞：将S180细胞培养于含体积分数为10%小牛血精的RPMI-1640营养液（含青霉素100×103?滋/L和链霉素100mg/L）中，置于37℃、含5%CO2的培养箱内。该细胞呈贴壁生长，取指数生长期的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化，机械吹打成细胞悬液，PBS洗涤2次，2000r/min离心5min，弃上清液，用无菌生理盐水稀释，调整到2×106/ml～3×106/ml个瘤细胞，随机先取5只健康昆明种小鼠，每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射，注意观察接种小鼠腹水生长情况，约1周后接种小鼠腹部明显增大、凸出。将其颈椎脱臼处死，固定于蜡板上，无菌抽取乳白色腹水液，以0.9%氯化钠溶液1：1稀释，经0.2%台盼蓝染色后计算活细胞数﹥95%，调整瘤细胞悬液浓度为6×106/ml个瘤细胞，每只小鼠右后肢臀部皮下接种0.2ml。共接种44只小鼠。24小时后用药。（六）实验分组和给药将44只造模成功的小鼠随机分为4组，每组11只，组内编号。4组分别为：消癌根高剂量组、消癌根低剂量组、阴性对照组及环磷酰胺组。所有处理自造模第二天开始：消癌根高、低剂量组分别按24g·kg-1·d-1、2g·kg-1·d-1灌胃，阴性对照组给相同剂量的蒸馏水灌胃，环磷酰胺组按20mg·kg-1·d-1腹腔注射。连续用药15天后停药，处死小鼠，剥离瘤块，用滤纸吸干后，称取瘤重。（七）评定指标（1）肿瘤抑制百分率（抑瘤率）：抑瘤率（%）=（阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）／（阴性对照组平均瘤重）×100%（2）给药期间，每隔3天用游标卡尺由体外测出瘤体的长径和短径，然后根据体积=长径×短径2，绘出肿瘤生长图。（八）统计学处理实验结果用均数±标准差（X±s）表示，实验资料采用SPSS10.0统计软件包处理。结 果（一）瘤重和抑瘤率消癌根对S180移植性肿瘤的抑制作用。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较，其瘤重均显著减轻（P﹤0.05）；消癌根高剂量组的瘤重与消癌根低剂量组比较亦明显减轻（P﹤0.05）；消癌根高剂量组与环磷酰胺组比较其瘤重有显著性差异（P﹤0.05）；环磷酰胺组抑瘤率最高。（二）肿瘤的生成曲线以时间为横轴，肿瘤体积为纵轴绘制肿瘤的生长曲线。讨论（一）小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞的选择国内研究者对S180生物学特性、免疫学、细胞系的建立及移植实验条件等方面做了较为深入的研究。由于其造模时间短、接种成功率高的特点，均一性好，目前此模型已广泛地用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。本实验采用购自中山医科大学肿瘤研究所的S180细胞，进行小鼠皮下肿瘤造模。经过对S180细胞的复苏、传代，右后肢臀部皮下接种，成功地造出44只荷瘤小鼠，造模成功率达100%。这一模型具有明显外部特征，容易观察、测量皮下瘤块的生长情况，以反映出各实验组的药效。另外，本实验中的荷瘤小鼠皮下肿瘤易剥离，以便较为精确地称重、计算抑瘤率。（二）消癌根对肿瘤的抑制作用本实验拟考察消癌根的抗肿瘤效果，以S180荷瘤小鼠为实验对象，将环磷酰胺设为阳性对照药，生理盐水组作为阴性对照组进行操作。环磷酰胺是临床常用的化疗药，其能有效地杀伤癌细胞（本实验其抑瘤率达到45.6%）。药效方面，消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%，消癌根低剂量组亦达到22.1%，消癌根高剂量组平均瘤重与低剂量组平均瘤重存在显著性差异（P﹤0.05）。这说明消癌根在抗肿瘤方面有一定疗效，并且存在着一定的量效趋势。消癌根的抗肿瘤机理可能是通过抑制捐资血管生成来实现的。将在以下实验中予以探讨。